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本制品是一种基于远红外荧光探针7-AAD特异性染色细胞膜丧失完整性的坏死细胞的特性开发的能够特异地对坏死细胞的细胞核进行染色从而检测细胞坏死的试剂盒。本试剂盒可与Annexin V-FITC/EGFP/PE、Calcein AM等联用而用于细胞凋亡与坏死或死活的检测，适用于流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备。

7-AAD，英文全称为7-aminoactinomycin D，中文名称叫做7-氨基放线菌素D，是一种能够嵌入核酸的荧光指示剂，形成的DNA复合物在546nm激发光下能够产生647nm的最大发射光，这一特性使其常用于多色荧光显微镜或流式细胞实验中。

7-AAD和碘化丙啶(PI)类似，是一种非细胞膜渗透性的荧光染料，不能穿过具有生物活性的细胞质膜，因此被用来区分正常细胞与坏死细胞，也可以被用于细胞固定或通透后的核酸染色。与碘化丙啶(PI)不同的是，被546nm的氩离子激光激发后，7-AAD的发射光谱较PI窄，且发射波长更长，对其它检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与多种488激发光激发的荧光染料联合使用，如FITC (异硫氰酸荧光素)、PE (藻红蛋白)、APC (别藻蓝蛋白)、Calcein AM等，在光谱的600nm左右有较弱的荧光，可用一般的荧光显微镜检测红色荧光，而在远红光650nm左右有较强的荧光，可用流式细胞仪FL3通道或配备650nm长通滤光片的荧光显微镜检测远红外荧光。

7-AAD的分子式为C62H87N13O16，分子质量为1270.45，CAS number为7240-37-1。插入DNA后的最大激发光波长为546nm，最大发射光波长为647nm。7-AAD插入DNA后的激发光与发射光光谱参考图1。

图1．7-AAD和DNA复合物的激发光谱与发射光谱。


本试剂盒内提供检测缓冲液，可以简单便捷地进行细胞坏死检测，同时又能维持正常细胞的状态。使用本制品联合Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡与坏死的效果参考图2。使用本制品联合Calcein AM细胞活性检测试剂盒检测细胞活力与坏死的效果参考图3。

图2．7-AAD细胞活力检测试剂盒联合使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(货号：YT131)检测THP-1细胞(货号：YTH6960)凋亡与坏死的效果图。THP-1细胞经Doxorubicin(货号：YTF0159)处理5h后的形态见图A；凋亡和坏死细胞的细胞膜被Annexin V-FITC染色成绿色荧光(图B)，坏死细胞的细胞核被7-AAD染色成红色荧光(图C)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

图3．7-AAD细胞活力检测试剂盒联合使用Calcein AM细胞活性检测试剂盒(货号：YTC0033)检测HT-29细胞(货号：YTF6410)活力与坏死的效果图。HT-29细胞经TSZ处理4h后的形态见图A；正常细胞被Calcein AM染色成绿色荧光(图B)，坏死细胞的细胞核被7-AAD染色成红色荧光(图C)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

组分	200T	1000T
20×7-AAD染色液	1mL	5mL
检测缓冲液	50mL	250mL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

• 如果有细菌或真菌污染，可能会严重影响检测效果。
  
• 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致坏死细胞的数量增加。
  
• 细胞经固定、通透和RNase处理后也可以使用7-AAD检测细胞周期，但更常用的是碘化丙啶(PI)。
  
• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

• 染色工作液配制：
  按照96孔板每孔100μL 7-AAD染色工作液的体系，按每5μL 20×7-AAD染色液加入95μL检测缓冲液的比例稀释7-AAD，参考下表配制适量的7-AAD染色工作液，需充分混匀。
  

  成分	1个样品	10个样品	100个样品
  20×7-AAD染色液	5μL	50μL	0.5mL
  检测缓冲液	95μL	950μL	9.5mL
  7-AAD染色工作液	100μL	1mL	10mL

  • 为得到比较理想的结果，可根据细胞类型和实际情况对20×7-AAD染色液在10-100稀释倍数之间进行适当调整。
    
  • 配制7-AAD染色工作液时注意避光，且须现配现用，不能长期保存。
    
  • 也可以用其它合适的缓冲液，如无血清培养液、HBSS(货号：YT902)或PBS溶液(货号：YTB1103)稀释20×7-AAD染色液。本试剂盒配套提供的检测缓冲液可在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果通常比PBS或HBSS更好。
• 悬浮细胞染色：
  
  • 细胞准备。细胞按照实验设计进行一定处理后，计数。取适当细胞600×g室温离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次。每个样品推荐的细胞用量为1×10⁶。
    
  • 染色。对于上一步骤的1×10⁶个细胞的沉淀，加入1mL 7-AAD染色工作液，重悬为单细胞悬液。37℃孵育细胞5～15min，不同的细胞最佳孵育时间不同。以5min作为初始孵育时间，根据自己实验的细胞进行优化得到最佳的效果。
    
    • 需要准备好仅含缓冲液的细胞样品用作流式细胞仪检测时的阴性对照，该缓冲液与配制7-AAD染色工作液的缓冲液宜保持一致。
  • 检测。孵育结束后可直接使用流式细胞仪检测，或将细胞铺开于孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上，在荧光显微镜下观察。7-AAD插入DNA后的最大激发光波长为546nm，最大发射光波长为647nm。
    
    • 在检测前，也可将细胞用PBS洗涤2～3次，最后用每个样品加入0.5～1mL检测缓冲液重悬细胞后用于检测，这样效果更好。
• 贴壁细胞的消化后染色：
  
  • 细胞准备。把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
    
    • 对于贴壁细胞，胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性。
  • 细胞合并：加入步骤3a中收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，600×g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS洗涤细胞一次，然后用PBS重悬细胞并计数。
    
    • 加入步骤3a中的细胞培养液非常重要，一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶。
  • 染色和检测：方法同“悬浮细胞染色”的2b-c。
• 贴壁细胞的原位荧光检测：
  
  • 本方法的优点是可以原位观察细胞坏死，缺点是部分坏死细胞可能由于不贴壁而检测不到。
  • 接种培养。将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。如果条件许可，在实验处理结束后，用可以对多孔板进行离心的离心机1000×g离心5分钟。
    
  • 洗涤。吸去细胞培养液，使用PBS洗涤细胞1～2遍。如果条件许可，每次在吸除PBS前1000×g离心5分钟。
    
  • 染色：加入适当体积的染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。37℃孵育细胞5～15min，不同的细胞最佳培养时间不同。以5min作为初始孵育时间，根据自己实验的细胞进行优化得到最佳的效果。
    
  • 检测：孵育结束后直接在荧光显微镜下观察。7-AAD插入DNA后的最大激发光波长为546nm，最大发射光波长为647nm。
    
    • 在检测前，也可将细胞用PBS洗涤2～3次，并在吸除PBS前1000×g离心5分钟，这样效果更好。

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